• Zielgruppen
  • Suche
 

Enzyme aus Basidiomyceten - einzigartige und effiziente Werkzeuge für die Biotechnologie

Ein Netzwerk aus Polykondensaten und Phenylpropanoid-Polymeren, das Lignin, bildet das Xylem von verholzten höheren Pflanzen. Durch seine Widerstandsfähigkeit gegenüber physikalischem und chemischem Abbau bietet es Schutz vor jedem umweltbedingten Angriff. Dennoch gedeihen viele Pilze der Stämme Basidiomycota und Ascomycota auf Holz und bilden dort eine beeindruckende morphologische Vielfalt an Fruchtkörpern zur Ausbreitung ihrer Sporen. Unter den xylotrophen Basidiomyceten haben Vertreter der Weißfäule-Pilze wie die Gattungen Pleurotus, Phanerochaete, Phlebia and Trametes besondere Aufmerksamkeit erlangt. Weißfäule basiert hauptsächlich auf extrazellulären Hydrolasen und Oxidoreduktasen, die von unterschiedlichen Genfamilien codiert sind. Diese einzigartigen Enzyme sind nicht nur eine funktionale Komponente vielfältiger Lebensgemeinschaften im Boden und im Wald und Teil des globalen Kohlenstoffkreislaufes, sondern auch viel versprechende Kandidaten für zukünftige industrielle Biotechnologien. Die Vorteile dieser extrazellulären Enzyme sind:

- Prozessstabilität

- gute Wasserlöslichkeit und

- eine Vielzahl von katalytischen Fähigkeiten.

Mögliche Anwendungen in den Bereichen Feinchemie, Biokraftstoffproduktion, Lebensmittel-, landwirtschaftliche, Papier-, Textil- und Kosmetikindustrie sowie auch in der Bodensanierung sind patentiert und in Übersichtsartikeln zusammengefasst worden. Die bedeutendsten Enzym-Typen sind Laccase (eine Phenol-Oxidase) und Haem-Peroxidasen. Unterstützung bieten H2O2 –erzeugende Enzyme wie Glucose- oder Glycerol-Oxidasen, Hydrolasen wie Glycosidasen und Esterasen sowie Redox-Mediatoren und Mechanismen, die freie Radikale erzeugen.

Laccase, Lignin-Peroxidase und Manganese-Peroxidase scheinen in Abhängigkeit vom Bedarf an Nährsubstraten in der betreffenden ökologischen Nische abgeschieden zu werden. Lignin-Peroxidase oxidiert direkt an der Proteinoberfläche durch einen Elektronen-Transferprozess mit langer Reichweite. Durch spektrometrische Analyse sind die Spaltprodukte von Seitenketten und aromatischen Ringen von phenolischen und nichtphenolischen Substraten charakterisiert worden. Laccase und Mangan-Peroxidase, die Phenole direkt, aber nichtphenolische Reste nur mit Hilfe von Mediatoren oxidieren, bauen Lignin stufenweise ab. Der Abbau intakter Lignocellulose durch einzelne Enzyme ist nicht effizient. Wahrscheinlich agieren die Peroxidasen synergistisch und benötigen kleinere Helfermoleküle, um verholztes Gewebe zu durchdringen.

Die Geometrie und katalytischen Schritte an den Kupferzentren von Laccasen sind detailliert erforscht worden. Verschiedene Unterarten, wie die gelben Laccasen, sind beschrieben. Enzyme mit besonderer Stabilität gegen Tenside, Metallionen oder physikalische Extreme sind in großangelegten Screenings entdeckt worden. Kürzlich hat ein kombiniertes Verfahren von gerichteter Evolution und rationalem Ansatz zu einer heterologen, hitzebeständigen Laccase mit hohem Redoxpotential geführt.

Eine andere, gut charakterisierte Oxidoreduktase aus Pilzen ist die so genannte „vielseitige“ Peroxidase. Die oxidierten Substrate reichen von Mn²+, dem Mangan-Peroxidase-Substrat, über Veratrylalkohol, dem typischen Ligin-Peroxidase-Substrat bis zu Phenolen, den Substraten der Peroxidase aus Coprinopsis cinerea. Die Hybrideigenschaften resultieren aus der Koexistenz verschiedener katalytischer Zentren in einem einzigen Enzym. Eine vielseitige Peroxidase aus Mycetinis scorodonius war das erste pilzliche Redoxenzym, welches in einem Aspergillus-Wirt mit hoher Aktivitätsausbeute produziert wurde. Das Enzym baut Carotinoide in Gegenwart von Wasserstoffperoxid ab und ist in der Lage, Molke, die Annatto enthält, zu bleichen. Jedes Jahr fallen mehrere Millionen Tonnen gefärbter Molke aus der Produktion von Gouda und Cheddarkäse an, und ungefähr ein Drittel des zugegebenen Farbstoffs verbleibt in der Molke. Chemisches Bleichen, Entsorgung in Kläranlagen sowie der enzymatischer Abbau sind die Alternativen. Zu diesem Zweck ist eine rekombinante Peroxidase in Gramm pro Liter Ausbeuten erzeugt worden; diese wird jetzt als MaxibrightTM vermarktet. Das erforderliche Wasserstoffperoxid kann elegant in situ von einer Glucose-Oxidase geliefert werden, welche durch ß-Galactosidase mit Substrat versorgt wird. Die Natur fungierte als Modell für diese Drei-Enzym-Lösung.

Die Verarbeitung von Papier, Textilien, Farbstoffen, Maische und Leder führt ebenfalls zu stark gefärbten Abwässern. Eine spezielle Klasse der Peroxidasen, die sogenannten „dye decolorizing Peroxidasen“ könnte sich in der Behandlung dieser Abwässer als wertvoll erweisen. Nur wenige dieser Enzyme sind bisher ausführlich beschrieben. Die erfolgreiche Behandlung stark verunreinigter Industrieböden mit lebenden Basidiomyceten zeigt, dass der gezielte Abbau von ökotoxischen Xenobiotika erreicht werden kann.

Eine weitere pilzliche Besonderheit ist die Peroxygenase. Das extrazelluläre Enzym des „Südlichen Ackerlings“, Agrocybe aegerita, oxidiert Toluol und 4-Nitrotoluol  über die korrespondierenden Alkohole und Aldehyde zu Benzoesäuren. Beide Sauerstoffatome stammen aus dem Co-Substrat H2O2. Die Peroxigenase ähnelt Cytochrom P 450 und Häm-Chlorperoxidase, indem sie benzylische  Hydroxylierungen katalysiert.

Die Valencendioxygenase des essbaren Basidiomyceten Pleurotus sapidus wandelt den Sesquiterpenkohlenwasserstoff (+)-Valencen über intermediäre Hydroperoxide zum Grapefruitaroma (+)-Nootkaton um. Die Expression des Enzyms in E.coli ist durch verschiedene Strategien einschließlich Kälteschock, Chaperon Co-Expression sowie die Anwendung von E. coli Mutanten verbessert worden. Bis zu 60 mg katalytisch aktives Enzym werden gebildet. Quantitative Substrat-Screenings haben bewiesen, dass das Enzym eine echte Lipoxygenase ist. Eine solch ausgeprägte Substrat-Promiskuität findet man bei Basidiomyceten nicht selten. 2-Oxoglutarat- and Fe2+-abhängige Dioxygenasen sollen in die Derivatisierung von Nukleinsäuren, insbesondere in die oxidative Modifikation der 5-Me Gruppe von Cytosine zu 5-Hydroxymethylcytosin involviert sein. Die Tet/JBP Homologen aus Basidiomyceten zeigen enge Verwandtschaft zu Genen, die für vermutete Transposasen codieren. Wenn sich diese Befunde bestätigen, wären Dioxygenasen und vielleicht auch die Valencendioxygenase ein weiteres Element der epigenetischen Regulation.

Weniger gut untersuchte Oxidoreduktasen sind Cellobiosedehydrogenase und Pyranose 2-oxidase. Beiden sind vermutlich am Ligninabbau beteiligt, arbeiten aber am Polysaccharidanteil des Lignins. Eine wirksame Hydrolyse erfordert die Aktivität von Cellulasen, Hemicellulasen, Esterasen, Phosphatasen und anderen Hydrolasen. Die hydrolytischen Aktivitäten korrelieren oft, aber nicht immer mit den Oxidoreduktase Aktivitäten. Einige Laccasen und Peroxidasen sind weniger stabil gegen Umgebungseinflüsse als extrazelluläre Hydrolasen, aber die Stabilität, der pI, die pH-Optima und andere in vitro ermittelte Eigenschaften können nicht immer auf eine komplexere chemische Umgebung oder die Situation in einem realen Ökosystem extrapoliert werden.

Die Hydrolyse von Cellulose oder Hemicellulosen wie Mannanen, Pektinen, Xylanen und Ähnlichem erfolgt durch die gemeinsame Einwirkung von endo- und exo-spezifischen Enzymen, entzweigenden und entesternden Aktivitäten im Verein mit Enzymen, die Oligomere und Dimere abbauen. Das Klonieren und die heterologe Expression von Pilzenzymen wie β-Glucosidase, α-Galactosidase, β-Mannosidase und Acetylesterasen waren in verschiedenen Expressionssystemen mit Ausbeuten bis in den Gramm pro Liter-Bereich und hohen Reinheiten erfolgreich. Diese Fortschritte werden den Weg zur technischen Produktion und industriellen Anwendung ebnen. Cellulose ist das häufigste Polysaccharid auf diesem Planeten und eine potentielle Glucosequelle. Basidiomyceten gehören zu den effektivsten Celluloseabbauern und verwenden dazu einen Satz von hydrolytischen Enzymen, zu dem Endoglucanase, Cellobiohydrolase und β-Glucosidase gehören. Mechanismen auf der Basis von Cellobiosedehydrogenase, die Hydroxylradikale generieren, vervollständigen die Ausstattung.

Die Peptidasen aus Basidiomyceten sind ebenso divers wie andere Enzymklassen. Sie sind oft durch ungewöhnliche Substratspezifität und Stabilität bei extremen pH-Werten, Temperaturen und Ionenstärken ausgezeichnet. Ihre Funktionen reichen von der Stickstoffversorgung bis zur Regulation von physiologischen Prozessen, indem sie die Lebensdauer anderer Enzyme limitieren. Hohe Peptidaseaktivität sind unter anderem in Flammulina velutipes, Armillaria mellea, Trametes versicolor, Meripilus giganteus und in  Hericium erinaceus gefunden worden. Oberflächenkulturen von Flammulina velutipes, einem Speisepilz mit großer Beliebtheit in der asiatischen Küche, wachsen gut auf verschiedenen industriellen Nebenströmen und produzieren auf Weizenglutenpellets über 160.000 aU mL-1 Peptidaseaktivität. Gelatine-Zymografie hat eine komplexe Gruppe sekretierter Peptidasen visualisiert. Darunter ist ein Enzym, welches die Deamidierung von l-Asparagin und l-Glutamine katalysiert. Das Enzym ist durch Schäumung und SEC zu elektrophoretischer Homogenität gereinigt worden und hat sowohl in nativer als auch in rekombinanter Form eine gute Toleranz gegen Hitze und Natriumchlorid, jedoch keine signifikante Homologie zu anderen konservierten Domänen von bekannten Asparaginasen oder Glutaminasen gezeigt.

Eine Peptidase aus Piptoporus soloniensis besitzt Milch dicklegende Aktivität ähnlich der von Chymosin aus Milchkälbern. Die  Asparaginsäure-Peptidase enthält eine Aminosäurepartialsequenz, die Säugetierherkünften ähnlicher ist als Chymosinsubstituten aus Pilzspezies wie Mucor miehei. Den SDS-PAGE Mustern zufolge schneidet diese Peptidase das κ-Casein in einer dem Chymosin vergleichbaren Weise und hydrolysiert β-Casein nur langsam, wie es von einem effizienten Chymosinsubstitut gewünscht wird.

Lipasen und Esterbindung spaltende Aktivitäten kommen in Basidiomyceten reichlich vor. Eine extra-zelluläre Lipase aus Pleurotus sapidus ist das erste Enzym der Lipase/Esterase-Familie aus einem Basidiomyceten gewesen, welches auf molekularer Ebene charakterisiert und in einem beherrschbaren Wirt exprimiert worden ist. Die Expression der cDNA in E. coli hat zu inclusion bodies mit geringer katalytischer Aktivität geführt. Denaturieren und Rückfalten hat ein katalytisch aktives Protein ergeben, welches sperrige Xanthophyllester mit hoher Effizienz hydrolysiert. Eine Signalsequenz dirigiert die Akkumulation des Proteins in den periplasmatischen Raum und vergrößert dadurch die Ausbeute an löslichem Enzym. Ester von benzylischen und Phenylpropansäuren mit Polysacchariden sind in Pflanzen weit verbreitet und das Substrat von verschiedenartigen Enzymen, die gegenwärtig als Feruloylesterasen beschrieben werden. Die klassische Einordung dieser Enzyme folgt den Substratspezifitäten. Neuerdings werden Pharmakophor-Modelle benutzt. Das wachsende Wissen um die Genome der xylotrophen Pilze wird zu sequenzbasierten und damit weniger angreifbaren Klassifizierungssystemen führen. Heute schon wird das Genfischen und die Zuordnung neuer Sequenzen zu einer bestimmten Enzymklasse durch die schnell wachsenden Genomdaten erheblich beschleunigt.